在现代生物技术领域，重组蛋白的表达与纯化是研究功能蛋白及其应用的重要环节。His标签（通常为6×His）因其结构简单、易于操作且具有高亲和力而被广泛应用于蛋白质纯化中。本文将详细介绍一种基于Ni-NTA树脂的His融合蛋白纯化方法，并提供优化策略以提高纯化的效率和目标蛋白的回收率。

实验材料与设备

- 表达His标签融合蛋白的宿主细胞及培养基；

- Ni-IDA或Ni-NTA亲和层析柱；

- 缓冲液A（含50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl）；

- 缓冲液B（含50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM咪唑）；

- 去离子水；

- 离心机、恒温摇床、真空泵等常规实验室设备。

实验步骤

1. 蛋白质表达

首先，在适当的条件下诱导宿主细胞表达His标签融合蛋白。通常使用IPTG作为诱导剂，浓度一般设置为0.1-1 mM。诱导时间根据实验需求调整，通常为4-16小时。收集菌体后，通过超声波破碎法释放胞内蛋白，离心去除未裂解的细胞碎片，获得含有目的蛋白的上清液。

2. 初步纯化

将上述上清液加载到预装好的Ni-NTA亲和柱上，让其自然流过柱子。随后用缓冲液A充分洗涤柱子，去除杂质蛋白。此步骤旨在减少非特异性结合物质，确保后续洗脱阶段仅包含目标蛋白。

3. 洗脱与浓缩

采用梯度洗脱的方式从柱子中分离出目标蛋白。开始时使用较低浓度的咪唑（如20 mM），然后逐渐增加至较高浓度（如250 mM）。随着咪唑浓度的升高，His标签融合蛋白会依次被洗脱下来。收集各组分并检测其纯度，选择纯度最高的部分进行下一步处理。

4. 再纯化与质量控制

如果初次纯化后的蛋白纯度仍不理想，则可重复上述步骤直至达到满意水平。此外，还需对最终产物进行SDS-PAGE分析以及Western Blot验证，确认其分子量是否符合预期，并检查是否存在降解片段或其他污染物。

注意事项

- 在整个过程中要严格控制pH值和温度，避免因环境变化导致蛋白变性。

- 对于某些特殊类型的His标签融合蛋白，可能需要调整咪唑浓度范围或者改变洗涤条件来获得最佳效果。

- 如果发现洗脱下来的蛋白活性较差，可以尝试加入保护剂（如甘油、蔗糖等）来稳定蛋白结构。

通过以上方法，我们能够有效地从复杂体系中分离出高纯度的His标签融合蛋白，为进一步的功能研究提供可靠的基础资料。